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云地日志

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测序经验谈之:测序技术进化  

2011-06-14 15:04:57|  分类: 二代测序 |  标签: |举报 |字号 订阅

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      20多年前的1980年代,我在华中师范大学学习《生物化学》。那时候完全没有想到,毫不起眼的DNA测序技术日后会变得如此重要,支撑起一个产业,养活无数的公司和个人,为GDP作贡献。这个产业链包括:仪器制造和销售、配套试剂开发和生产、代客测序服务、下游软件开发、以及生物信息学分析及服务。

 DNA测序技术的进化 - Garification - 云地小院子

 

一、50年简史

1970年代,Gilbert等发明化学法,Sanger发明酶法(双脱氧链末端终止法)。信号检测技术为放射性核素标记+放射自显影。手工新鲜配制聚丙烯酰胺凝胶,在-20度低温冰箱里进行放射自显影,在暗房里冲洗X光片,都是技术活。

1980年代,发明基于Sanger法的自动测序仪,平板凝胶电泳。荧光标记逐步代替放射性核素标记;计算机图象识别逐步代替放射自显影。

1990年代,毛细管电泳逐渐取代平板凝胶电泳。2001年取得里程碑式的成就,完成人基因组计划。

2000年代,发明第二代测序仪。Illumina在竞争中取得绝对优势。

2010年代,发明第三代测序仪。


二、三代测序技术

第1代:

化学原理:Sanger双脱氧链末端终止法。

仪器类型:毛细管电泳仪。

主要厂商:Applied Biosystems (ABI)。

代表仪器:ABI 3730XL。

测序读长:1000碱基左右。

测序通量:大约96k/run。

 

第2代a:

化学原理:平行测序-焦磷酸测序。同一个生物化学反应,形成2个产物:焦磷酸和氢离子。将焦磷酸转化成荧光信号进行检测,就是罗氏的454;检测质子浓度(pH值)就是ABI的Ion PGM和Ion Proton。

仪器类型:荧光检测仪;半导体检测仪;pH值检测仪。

主要厂商:Roche (罗氏)、Life Technologies (即原ABI) 。

代表仪器:Roche的Genome Sequencer FLX;Life Technologies的Ion PGM和Ion Proton。

测序长度:中等长度,几百碱基。

测序通量:比较低,每轮测序产出几百兆到几个G碱基。

 

第2代b:

化学原理:平行测序-边合成边测序或者边连接边测序。信号放大通过桥式PCR (bridge PCR)或者乳液PCR (emulsion PCR)完成。获得海量的短片段后,通过软件进行拼接、组装,得到整个基因组的全长序列。

仪器类型:荧光检测仪。

主要厂商:Illumina、Life Technologies。

代表仪器:Illumina的HiSeq X, HiSeq 2500/1500,HiSeq 2000/1000, MiSeq;Life Technologies的SOLiD。

测序长度:比较短,每个片段几十至2x300碱基,但是片段数量非常多,达到几百兆条。

测序通量:非常高,Illumina HiSeq X高达1.6 Tb/run。

 

第3代:

化学原理:单分子测序。DNA分子单链穿过纳米孔,碱基被依次切断掉进半导体检测孔,导致电位或者荧光变化。速度相当快(1-3bp/s),但是错误率比较高,一个片段需要重复测序多次以取得准确的碱基序列。

仪器类型:纳米孔。

主要厂商:Pacific Biosciences。

代表仪器:PacBio RS。

测序长度:非常长,每个片段几十万碱基。

测序通量:比较低。


第4代:

虽然有产品宣称属于第4代,性能暂不明朗,有待观察。


三、各家二代测序技术的优缺点

      二代测序的仪器设备可以归纳为3个家族:Ion PGM、Ion Proton与454是一个类型,属于焦磷酸测序;Illumina是一个类型,属于边合成边测序;SOLiD是一个类型,属于边连接边测序

      Ion PGM、Ion Proton与454三者基于同一个生物化学反应。这个反应释放出两种产物:焦磷酸(PPi)和氢离子(H+)。454检测焦磷酸,Ion PGM和Ion Proton检测氢离子。454通过一系列的酶反应,把焦磷酸转变为荧光信号,检测荧光。Ion PGM和Ion Proton把质子转变为电信号,检测pH值。 目前的技术无法检测单个PPi和H+,所以它们都需要通过PCR来增加PPi和H+的数目,从而把信号放大到仪器可以检测的水平。其PCR是在油包水形成的乳液里大规模进行的,称为乳液PCR (emulsion PCR)。这三个平台具有血缘关系。事实上,它们是由同一位科学家发明的,其优点和缺点也一样:都要进行难以操作、重现性不太好的乳液PCR;对于比较长的单碱基重复序列,比如AAAAAAAAA等,进行序列测定都比较困难。注意:这里说的重复序列不是ATATATAT、GCTAGCTAGCTA等多碱基重复(STR)。单碱基重复与STR序列都难以准确测定,但是原因不一样,对策也不一样。

      Illumina平台不存在这个问题,能精确测定单碱基重复序列和STR序列,无论多长。但是Illumina平台也有缺点,其短板是要求样本的碱基复杂度越高越好:对于每一个位置,要求A, G, C, T四种碱基都有,不能只有一两种碱基;而且每种碱基的比例最好都接近25%。碱基复杂度也可以换个角度称为碱基平衡度,意思是一样的。

      SOLiD已经停产。2014年,罗氏454也停产了。

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