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立身娉婷北高峰,花事纷纭心事秾。飓风和雨吹折后,病枝弱叶一扫空。

 
 
 

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测序经验谈之:小RNA文库构建  

2011-06-23 23:11:03|  分类: 二代测序 |  标签: |举报 |字号 订阅

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这是用TruSeq试剂盒得到的胶图,来自1 ug 总RNA:

miRNA-Seq Gel Images - Garification - 云地笔记
 
 
这是用v1.5试剂盒得到的胶图,人类和小鼠的脑组织,1 ug总RNA。小鼠没有30碱基的条带。
miRNA-Seq Gel Images - Garification - 云地笔记
  

大部分miRNA长度在18-25 bases之间。18 base 的小RNA加上接头(118碱基)是 136 bp,25 base的小RNA加上接头是143 bp。在PAGE胶上电泳时,特别是在Bioanalyzer上,它们会走得稍微快一点,大约7 bp,看到的条带分别是144碱基和150碱基。所以,Truseq miRNA libraries 的电泳条带应当在145-160 bp之间。 

有时候,电泳胶图中会出现1条位于130-138bp范围内的短带。这条带不是小RNA,而是某种可以被PCR扩增的adapter concatamer (已经通过测序鉴定)。有时候,这条带显示为a small smear.  

在研发过程中,已经发现提高逆转录反应的温度可以减弱这条杂带:当逆转录反应温度为 44-47度时, 仍然可以看到这条引物二聚体带;50度时,条带消失。

如果逆转录反应温度是50度,仍然出现这条杂带,可能的原因有两个:一是PCR仪的温度不准确,需要校正;二是实验操作过程中,反应混合物没有及时放在冰上。

注意:对于小鼠来说,没有30碱基的小RNA。

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