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云地日志

立身娉婷北高峰,花事纷纭心事秾。飓风和雨吹折后,病枝弱叶一扫空。

 
 
 

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测序经验谈之:一代测序原理  

2011-06-26 10:16:46|  分类: 二代测序 |  标签: |举报 |字号 订阅

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DNA测序原理:一代和二代 - Garification - 云地小院子

1970年代发明了两种DNA测序技术:Frederick Sanger发明的酶法,即双脱氧链末端终止法,也叫Sanger法;Maxam和Gilbert发明的化学降解法。

 

Sanger法
        DNA溶液分成4份,加入DNA聚合酶和引物,再分别加入4种dNTP与1种限量的ddNTP的混合物,进行PCR反应。由于ddNTP随机掺入,PCR产物从引物之后的第一个碱基开始,每一个位置都有可能是ddNTP。由于ddNTP缺乏链延伸所需要的3'-OH,链的延伸就选择性地在G、A、T或C处终止。这样的PCR产物与普通PCR不一样,不能形成一条电泳带,而是一组长度相差一个碱基的成百上千种片段。它们具有共同的起始点,终止在不同的的核苷酸上,每一个碱基都有相同的概率被终止。

每一次序列测定由一套4个单独的反应构成。

ddNTP用放射性核素或者荧光基团标记。通过变性凝胶电泳来分离这些链终止产物,使它们按照长短排队。如果用放射性核素标记,由于只有一种颜色,AGCT4种链终止反应要分开放在4个不同的离心管里进行,电泳也要分道分别进行;如果是荧光标记,因为有4种颜色可以使用,AGCT4种链终止反应可以混合在一起,在同一个离心管里进行,电泳也可以在一道毛细管里进行。荧光标记既安全,也更加方便。

读取AGCT4条放射自显影图谱,把4道数据拼在一起;或者简单的1条荧光电泳图谱,得到碱基序列。

荧光标记的Sanger法便于机器自动化操作,被所有的第一代测序仪采用,称为Sanger测序。

 

化学降解法
        把DNA溶液分成几份,用多种化学试剂分别处理,造成DNA在特异的碱基位点或位点组合处被切断,产生一组长度不同的DNA片段。切割反应的产物在不同的泳道里经凝胶电泳分离。根据片段长度和片都末端的碱基或碱基组合,运用拼图游戏的技巧,将DNA序列破译出来。

此法便于人力手工操作。在自动化测序仪发明以后,基本没人使用。

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