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立身娉婷北高峰,花事纷纭心事秾。飓风和雨吹折后,病枝弱叶一扫空。

 
 
 

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测序经验谈之:TRIzol与二代测序  

2015-01-17 17:10:04|  分类: 二代测序 |  标签: |举报 |字号 订阅

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测序经验谈之:TRIzol法提取RNA - 陈云地 - 现代汉语和基因的美感寻找

TRIzol是一种总RNA提取试剂,用于从培养细胞或组织样本中提取总RNA。TRIzol含有苯酚、异硫氰酸胍等成分,既能快速地裂解细胞,又能有效地抑制细胞破裂时释放的核酸酶的活性,避免RNA被降解,保持RNA完整。


      一、组成成分及功效

  TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚虽然能有效地变性蛋白质,但是不能彻底抑制RNA酶活性,因此TRIzol中还加入了异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等RNA酶抑制剂。

苯酚:裂解细胞,使细胞中的蛋白质和核酸解聚,释放到裂解液中。

异硫氰酸胍:强力蛋白质变性剂,可以破坏蛋白质二级结构,导致细胞解体,使核蛋白质与核酸迅速分离。

8-羟基喹啉:0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNA酶活性。它与氯仿联合使用可以增强抑制效果。

β-巯基乙醇:破坏RNA酶中的二硫键,从而破坏RNA酶的活性。 
 

二、特点

1、速度快

TRIzol用于快速提取总RNA,适合人类、动物和植物的新鲜冷冻组织样本,培养的细胞样本,以及培养的细菌样本。无论少量组织(50-100 mg)还是大量组织(≥1 g),少量细胞(5×10^6 个)还是大量细胞(>10^7 个),效果都很好。

TRIzol操作简便,可以在1小时内完成提取,而且适合同时处理多个样品。

100 ml TRIzol可以用于抽提100个重50-80 mg的组织样品。

       2、产量高

      使用TRIzol,一百万个 (1 x 10^6) 细胞可以提取 5-15 ug 总RNA,一毫克 (1 mg)组织可以提取 1-10 ug RNA,产量相当高。

       3、纯度好

       TRIzol法抽提得到的总RNA纯度高,DNA和蛋白质污染很少,如果用TE溶解RNA,其 OD260/280 ≥ 1.8。 适合二代测序、基因芯片、RNA 印迹、点杂交、poly(A)+ -mRNA选择、体外翻译、RNA酶保护和分子克隆等多方面应用。

       如果质检发现抽提得到的总RNA中残留有少量DNA,可以用不含RNA酶的DNase I 处理总RNA。

       4、能同时提取DNA、RNA和蛋白质

       利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质不同,可以通过分层,从同一个样本中同时提取RNA(上层)、DNA(中层)和蛋白质(下层)。

        5、可提取小RNA

        TRIzol试剂能促进不同种类、不同分子量的多种RNA析出。

        高分子量RNA:介于7 -15 kb之间,条带不连续,主要是mRNA和hnRNA。

        rRNA:高分子量RNA中占优势的两条带分别位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)处,它们是rRNA。rRNA在总RNA中占比高达90%以上,对于以检测基因表达、转录组、融合基因为目的的二代测序来说是极大的浪费。解决这一问题的方案是:用Ribo-Zero或其他专门试剂/方法消除rRNA,然后以ribo-zero处理的产物为模板进行二代测序。

        低分子量RNA:介于0.1 - 0.3 kb之间,主要是5S的tRNA。

        若要提取small RNA,宜-70°C沉淀过夜。 

                 

      三、操作方法

  冷冻结冰的组织样本加入TRIzol,用研钵或其他方法在液氮中磨碎匀浆,室温孵育5分钟后加入氯仿,高速离心15分钟,样品分成水样层、中间层和有机层;分别收集各层。RNA在水样层,加入异丙醇沉淀RNA;DNA在中间层,加入乙醇沉淀DNA;蛋白质在有机层,加入异丙醇沉淀蛋白质。 

  注意TRIzol对人体有害,操作时戴一次性手套,防止溅出。 

  1. 样品制备。

      像肌肉、脂肪组织、植物块茎等富含蛋白质、脂肪、多糖或细胞外物质的样本,需要额外的分离步骤,去除干扰物质。

      加入适量TRIzol的样本冷冻匀浆后,12,000×g、2-8°C离心10分钟去除匀浆中不溶解的物质。沉淀包含细胞外膜、多糖以及高分子量DNA等杂质,上清液中含有RNA。如果样品是脂肪组织,离心后有大量脂肪漂在最上层,应该去掉。

  2. 分离RNA。 

      将清亮的匀浆溶液转移到干净的试管中,室温(15-30°C)孵育5分钟,使核蛋白体完全分解。

      在每1 ml TRIzol裂解液中加入0.2 ml氯仿,盖紧样品管盖,用手用力摇晃离心管15秒,30°C孵育2-3分钟。

      在2-8°C下以不超过12,000×g的离心力高速离心15分钟。

      离心后混合物分成三层:下层是红色的苯酚-氯仿层,中间层,上层是无色的水样层。RNA在水样层。水样层体积大约是所加TRIzol体积的60%。

  3. 沉淀RNA。 

      将水样层转移到干净的离心管中。如果希望提取DNA和蛋白,则保留有机层。在水样层中加入异丙醇来沉淀RNA。最初均浆时的每1 ml TRIZOL对应0.5 ml异丙醇。将混合的样品在15-30°C条件下孵育10分钟,并在2-8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟,RNA沉淀于管底。去除上清夜。

  4. 洗涤RNA。 

      用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次。每1 ml的 TRIZOL至少加1 ml 75%乙醇,旋涡振荡混合样品。在2-8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟,RNA沉淀于管底。去除上清夜。 

  5. 溶解RNA。 

      空气干燥RNA沉淀。注意不能让RNA沉淀完全干燥,那样会极大地降低它的可溶性。用无RNA酶的水溶解RNA,在55-60°C下孵育10分钟。RNA也能用100%去离子甲酰胺再溶解。RNA样本保存于–80°C。

 

       四、注意事项

  1、从少量组织(1-10 mg)或细胞(10^2-10^4)分离RNA:往组织或细胞中加入800 ul TRIZOL。待样品裂解后,加入氯仿并进行步骤2中的抽提操作。在用异丙醇沉淀RNA之前,加入5-10μg无RNA酶的脂质体作为水样层的载体。为降低黏度,在加入氯仿前用26号注射器抽吸两次以切断基因组DNA。脂质体会留在水样层中并和RNA共析出。在浓缩到4 mg/ml之前,它不会抑制第一链cDNA的合成,也不会抑制PCR。 
  2、在匀化后和加入氯仿之前,裂解液于 -80°C至少可以保存1个月。RNA沉淀在75%的乙醇中于4°C至少可以保存1周,在 -20°C至少可以保存1年。  


      五、TRIzol的配制及保存

  1、配方

      在2000 ml烧杯中加入以下物质,混合均匀: 
  500 mL 重蒸苯酚; 
  250 g 异硫氰酸胍; 
  293 mL 蒸馏水; 
  17.6 mL 0.75M 柠檬酸钠溶液(pH≥7.0) 
  26.4 mL 10% sarcosy(十二烷基肌氨酸钠)溶液 
  50 mL 2M NaAc溶液(pH≥4.0)

      2、保存

      TRIzol溶液需于4℃低温保存。保质期1年。 


六、二代测序相关备注

1、新鲜外周血样本如果需要异地提取RNA,可在分离白细胞后,立即用TRIzol处理得到裂解液。白细胞裂解液用干冰运输。

2、白细胞的正常值为4-10×10^9个/L。1 mL 人类或动物的全血可以抽提10-20 μg 总RNA。3-5 mL全血可得到30-60 ug total RNA。

3、按Illumina建议,转录组二代测序需要3 ug 总RNA。如果样本少,最好不要少于1 ug。再少的话,二代测序数据表面看起来没问题,数据产量和%Q30都能达到预期要求,但是数据的内在质量如何就很难说了。

4、取30 ug总RNA分离small RNA,可得到0.5-2 ug <200bp的RNA。

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