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测序经验谈之:植物样本  

2015-01-07 17:12:47|  分类: 二代测序 |  标签: |举报 |字号 订阅

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如果粗线条地看问题,植物DNA测序与动物及人的DNA测序没有本质区别,能把动样本测序做好,理所当然就能把植物样本测序做好。但是,实际情况并不是这样的。在许多细节上,它们有很大不同。这些细微差别,有时候会导致二代测序失败,带来大损失。细节是魔鬼。不注重细节,就会遇到鬼。且看案例。

 

1、故障现象

两个植物DNA样本进行二代测序,数据分析后发现它们的%duplication 异常偏高:样本68为21%,样本69更是高达65%。这两个样本经过方法改变,前后进行了两次文库构建和测序,数据都不理想。

 

2、分析结论

根据对实验记录的梳理分析,认为问题发生的逻辑链条是:

 植物DNA样本含有某些未知的杂质  -> 仪器测定得到的DNA浓度值虚高,不真实 -> 按正常流程取适量DNA样本建库,实际可用的DNA量低于预期,相当于用标准流程进行了low input建库 -> 数据的%duplication升高。

 其中样本69由于建库得到的文库量偏少,增加了2个PCR循环,导致其%duplication更高。Illumina推荐10个PCR循环,并建议对未知样本进行梯度测试来优化PCR循环次数。但是在二代测序实践中,每个样本都进行循环数优化成本太高,很不现实,几乎没有人会这么做。人们主要根据经验来作决定。

  

3、实验数据

 1)DNA质检

DNA质检包括NanoDrop浓度测定和琼脂糖凝胶电泳两项检验。浓度测定数据如下表。琼脂糖凝胶电泳是根据DNA浓度测定值取等量DNA样本走胶。由于观察到样本条带的亮度明显比marker带弱,所以判断样本“有效浓度低”;由于观察到样本没有降解,所以判断“可接受”。

有效浓度低的常见原因是样本中含有杂质,干扰了仪器测定的读数。因为植物样本的组成成分比较复杂,而且变化多端,比如说含糖量高等等。仅仅根据上述两项检验数据,无法判断杂质具体是哪一种,因此难以采取准确地针对性措施对样本进行纯化。基于这些考虑,决定直接建库、测序。

样本编号

样本类型

浓度 (ng/μl)

OD260/280

质检结论

68

DNA

509.5

1.89

有效浓度低,可接受

69

DNA

382.5

1.90

有效浓度低,可接受

 

测序经验谈之  植物样本重复率高 - 陈云地 - 现代汉语和基因的美感寻找

  

2)第一次建库测序

因为第一次测序数据不理想,整个实验包括建库和测序被重复了一次。也就是说,两个样本都进行了两次建库和两次测序。为了提高数据质量,第二次建库在方法上作了改变。

第一次建库是先进行PCR,然后对PCR产物进行切胶回收,选择650 bp的文库范围,因为指定插入片段长度500 bp.

文库质检结果如下:

样本编号

文库浓度 (ng/ul)

片段长度 (bp)

68

7.25

646

69

6.21

693

文库用Agilent 2100 Bioanalyzer进行质检得到的图谱正常。

参照之前同类样本的测序经验确定上机浓度。68得到的cluster密度为500 K/mm2, 数据产量为31 Gb;69的cluster密度为128 K/mm2,数据 产量是7 Gb。数据都非常少,测序失败。

检查上机流程没有发现问题。因此尝试改变方法重新建库,先切胶,后PCR。希望能够提高数据量。

 

3)第二次建库测序

第二次建库在末端修补后即行切胶,选择文库长度为650 bp区域,然后进行PCR。从Illumina NGS实验原理来说,先切胶、后PCR,与先PCR、后切胶,都是可以的。

文库的琼脂糖胶电泳检测结果如下:

 (图略) 

因为文库69的条带很弱,不够测序所需,因此增加了两个PCR循环。对于DNA建库来说,应该说10-12个PCR循环都在正常范围内。

第二次建库得到的文库,其2100图谱正常。

文库浓度测定数据如下。与之前的同类文库相比,浓度要低很多。参照第一次测序的经验,适当提高上机浓度,得到的cluster密度很好, 1033 K/mm2,是Illumina仪器的理想cluster密度。但是数据经过分析,发现这两个样本的%duplication都偏高.

样本编号

 浓度 (ng/ul)

片段长度 (bp)

68

5.97

598

69

9.01

594

 

4.结论和建议

比较这两次测序数据,结合以前大量样本的测序经验,可以认为,PCR之前切胶与PCR之后切胶,差别不大。理论上,它不应当影响%duplication的高低。即使有,影响也应当很小才是。考虑到第二次测序数据,同样是先切胶,后PCR,重复率差别这么大,也从一个侧面支持了切胶先后并不重要。

能够对%duplication产生重大影响的因素主要有两个:一是PCR循环次数过多,一是样本投入量太少,总之就是样本DNA被过度扩增。

从68和69两个样本的差异,可以看出PCR循环次数对于%duplication影响是相当大的。但是,10个循环和12个循环都属于正常范围,并不太离谱;其次,在PCR循环次数只相差2个的情况下,%duplication却相差高达44%,二者明显不成比例。所有这一切,无不说明在这一现象的背后,还存在着影响更大、更关键的原因。PCR循环次数不太可能是本次实验%duplication异常增高的主要原因。

所以,问题的根源只能是:建库时样本投入量不足。

本次实验样本DNA投入量不足的原因是:由于样本的有效浓度低(琼脂糖胶电泳图谱证实),导致按常规方法取样本时,实际有效的DNA量偏少。

植物品种不同,提取得到的DNA组成成分差别很大,变化多端。在测序之前,实难根据经验穷尽所有情况并采取妥善的处理措施。因此,对于植物样本,只要在DNA质检时发现有任何异常,哪怕只是蛛丝马迹,都要严肃认真地对待,尽一切可能采取预防措施,方能最大限度地减少损失,提高测序成功率。切不可马虎大意,碰运气。

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