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云地日志

立身娉婷北高峰,花事纷纭心事秾。飓风和雨吹折后,病枝弱叶一扫空。

 
 
 

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DNA提取原理  

2015-02-12 16:36:25|  分类: 二代测序 |  标签: |举报 |字号 订阅

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DNA提取原理(稿) - 陈云地 - 现代汉语和基因的美感寻找

 

一些背景知识

        DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。其钠盐比游离核酸更易溶于水。DNA钠盐的水溶液呈黏性胶体状。

        天然状态下,DNA以脱氧核糖核蛋白(DNP)的形式存在于细胞核的染色体中。从细胞中提取DNA的基本方法是:1、分离DNP,2、去除核蛋白,3、除去糖类、RNA 和无机离子等,从而分离出纯净的DNA。

        DNP的溶解度受盐浓度影响。随着盐浓度的增加,DNP的溶解度也增大。 在低浓度盐溶液中,DNP几乎不溶解。在0.14 mol/L的氯化钠溶液中,DNP溶解度最低,只有它在水中的溶解度的1%。在1 mol/L的氯化钠溶液中,DNP的溶解度比在水中的溶解度高2倍。

 


真核细胞的DNA提取

       1、 把各种形态的样本处理成离散的细胞,尽可能去除杂质。液体培养的大肠杆菌离心去除培养液。悬浮培养的细胞先离心去除培养液,再用PBS洗2次。贴壁培养的细胞用蛋白酶消化使之游离,离心去除培养液,再用PBS洗2次。血液进行溶血或者分离出白细胞。组织块剪碎后,低温研磨匀浆。

        2、在螯合剂EDTA及表面活性剂SDS存在的条件下,用蛋白酶K消化、破坏细胞构造,获得细胞裂解物。       

        3、用酚/氯仿处理细胞裂解液,去除蛋白质。苯酚/氯仿是蛋白质变性剂。它们一方面变性蛋白质,破坏DNP,一方面抑制DNase的活性,防止DNA酶对DNA进行降解和破坏。在用苯酚处理细胞裂解物的过程中,核蛋白与DNA分开,DNA游离出来,溶解于水相;蛋白质变性沉淀。DNA与蛋白质二者分开。

        为了尽可能多地去除蛋白质和尽可能多地回收DNA,这一步可以分几次进行。比如说先用酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提1次,再用氯仿/异戊醇抽提1次。酚是蛋白质变性剂,但是会有10-15%溶解于水,影响DNA回收。氯仿不溶于水,苯酚溶解于氯仿。所以氯仿可以减少溶解在水里的苯酚的量。异戊醇是为了减少震荡过程中产生的气泡,因为气泡会阻碍有机溶剂与蛋白质充分接触,削弱它们之间的相互作用。

        4、通过高速离心,酚/氯仿处理后的细胞裂解物分成3层:上层为水相,含有溶解的DNA;下层为有机相,即酚/氯仿层;二者之间还有灰白色的薄薄的一层,是已经变性的、不溶解的蛋白质。小心地、尽可能多地取出水层。

        5、利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA 。

        乙醇沉淀DNA时要加入0.1倍体积的3 M NaAc。因为DNA钠盐的水溶性更好。       

        要使DNA有效地、尽可能多地沉淀,乙醇的终浓度最好是70%左右。标准的做法是加入2.5倍体积的无水乙醇。乙醇的终浓度为2.5v/(1v+2.5v)=71%(v/v)。也可以加入2倍体积的无水乙醇,此时乙醇的终浓度是67%。

        由于无水乙醇比95%的乙醇在价格上贵很多,很多实验室常用95%乙醇来代替无水乙醇。另外,离心管体积有限,为了操作方便,也有人会减少酒精的加入量。在这些情况下,都要关注乙醇的终浓度是否足够高,从而高效地沉淀DNA。

        异戊醇也可以沉淀DNA。异戊醇的沉淀效率比乙醇更高。缺点是会同时沉淀更多的杂质,使DNA的纯度降低。所以,只有在DNA产量偏少的情况下,才会使用异戊醇。


 

方法特色

        所提取的DNA保持天然状态。

        酚/氯仿法是一切DNA和RNA(包括small RNA、lnc RNA等等)提取方法的基础。各种试剂盒都是在此基础上衍变出来的,万变不离其宗。

       

       

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