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云地日志

立身娉婷北高峰,花事纷纭心事秾。飓风和雨吹折后,病枝弱叶一扫空。

 
 
 

日志

 
 

二代测序——RNA RIN值的困惑  

2015-03-13 22:04:48|  分类: 二代测序 |  标签: |举报 |字号 订阅

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RNA测序难度比DNA大,问题也相对多一些。下面的问题,与RNA质控最重要的参数RIN值有关。通常,RIN值越高,表明RNA质量越好,则二代测序的数据质量也越高。Illumina权威建议,用于二代测序的RNA样本,RIN值要求>=8.0。然而,我们却遭遇了RIN>=8.0,测序数据质量低于预期的异常情况,困扰着我们脆弱的神经。

一、RIN值大于8,数据却很差

一批总共20RNA样本,经Agilent 2100 Bioanalyzer检测,RIN值在6.8-8.6之间,其中有7个样本的RIN值大于或者等于8.0,应该说这批RNA样本的总体质量不错。可是测序数据不给力。虽然每个样本的数据产量和%Q30都很好,达到甚至超过期望值,但是覆盖率(coverage)分布曲线却呈现5低、3高的不均衡图式(图1略)。

我们期望样本能够被均衡地测序,测序数据能够平均地覆盖整个基因的所有区域。如果3端覆盖度高,5端覆盖度低,通常提示样本RNA降解。因为我们采用的二代测序RNA文库构建路线是首先通过polyT磁珠富集、筛选带polyA尾巴的mRNA,同时去除rRNA等各种“杂质”,然后进行片段化、随机引物反转录合成cDNA一链、二链、末端修复、3端加A、接头连接和PCR,构建文库。如果RNA样本存在部分降解,第一步mRNA富集所获得的产物就会3端的多、5端的少,因为断裂之后的5端片段没有polyA尾巴,无法被polyT磁珠捕获,富集之后它们就被丢失了。[原创作品。欢迎转载。转载请注明作者:陈云地] 体现在测序数据中,就是覆盖3端的测序片段多,5端的少。在覆盖率分布图中呈现“一头高、一头低”的不均衡图式。

令人迷惑不解的是,这批样本的RIN值并不低。RIN值是RNA完整度的度量。RNA越完整,RIN值越高;RNA降解单看RIN值,我们不能判断RNA样本存在降解。数据质量与样本质量不相称,这才是让人备感困惑的地方。

难道是实验操作过程中出了问题?难道是实验室科学家技能不高,或者没有严格遵守操作规范,文库构建过程中样本或反应物被RNA酶污染,导致RNA被部分降解了?难道是试剂质量不过关,里面混有少量RNA酶?

 只要问题出现,就决不能放过。3个月后,我们对该批样本有一次进行了质检,发现RIN值没有太大变化。再次进行文库构建和二代测序,得到的数据质量与第一次相同(图2

 

二代测序——RNA RIN值的困惑 - 陈云地 - 基因和现代汉语的美感寻找

2、第二次测序部分数据。

 

 第二次测试,我们增加了一个已知质量很好的RNA样本作为阳性对照,同时进行文库构建和测序,以监控实验操作过程。结果,对照样本的coverage分布曲线是均衡的,数据质量正常(图3)。

 

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3、对照样本的覆盖率分布图。

 

对照样本的良好表现并没能驱散人们心头的雾霾。难道那个对照[原创作品。欢迎转载。转载请注明作者:陈云地]样本只是碰巧做好了,而那20个失败的样本数量更多,它们才真正体现了我们实验室科学家的实际水准?我们陷入了更深的焦虑之中。

我们开始检查每一个环节……

二、非典型RNA质量

按“惯例”,检查从后往前倒推。一步一步查下来,都没有发现异常。其实越正常,我们越打鼓。直到RNA样本质检图谱,我们似乎遭遇了“非典”——非典型性RNA质量。

RNA质检包括Agilent 2100 Bioanalyzer检验、Qubit浓度测定和琼脂糖凝胶电泳3项检验。其中RIN值是最被看重的。因为RIN值整体不错,大家都忽略了琼脂糖凝胶电泳图。当我们仔细看这些图(图4)的时候,似乎发现了蛛丝马迹:样本与对照不一样,有差别。

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4、部分RNA样本和对照样本CT的琼脂糖凝胶电泳图。

 

比较这些样本与对照样本,可以发现它们之间存在两个差别:1、样本有杂带,对照没有;2、样本存在一定程度的降解,对照没有。对于第一点,全部20RNA样本都存在相同模式的杂带,原因不明。对于第二点,对照样本的28S带亮度是18S带的2倍以上,而其余样本,这两条带的亮度要么接近,要么反过来,18S28S的更亮。这两条带相对亮度提示,样本RNA存在一定程度的降解。

为了进一步检验什么样的RNA谱图是正常的,我们检查了很[原创作品。欢迎转载。转载请注明作者:陈云地]多来自其他样本的RNA琼脂糖凝胶电泳图。下图(图)是从其他组织样本中提取的RNA,可以作为进一步的对照。可以看出,这两个样本背景干净,没有上述20个样本那样的杂带。

这个案例之所以困扰我们,是因为虽然数据质量不好,RIN值却不差,有些还大于8。这样的RIN值给所有人都造成了深刻的错觉。表1(略)列出了这20个样本的RIN值,看起来都不错。结合琼脂糖凝胶电泳图,我们也许可以这样说:RIN值未能全面、准确地反映这20RNA样本的真实质量。

三、故障原因浅探

我们还没有找到这一问题的根本原因。考虑到与此相关的一些观察和线索也许有助于大家避免同样的问题在今后再次发生,特提出来供大家参考。

首先,这批样本是已经剪碎并且浸泡在TRIzol中的组织。我们建议使用RNAlater来保护新鲜冷冻组织样本里的RNA,不建议使用TRIzol

其次,取200 uL这批样本的TRIzol裂解液,平均能够提取得到48 ug total RNA;而对照样本要取1000 uL,才能平均提取20 ug total RNA。差别这么大,有可能是因为往剪碎的组织中加TRIzol时比[原创作品。欢迎转载。转载请注明作者:陈云地]例不当。如果TRIzol偏少,组织偏多,就能导致200 uL裂解液中含有的组织量大于1 mL 对照样本,从而提取出更多的总RNA。如果TRIzol偏少,则对于RNA的保护力度就会不够。这可能是该批样本RNA降解的原因。

由于信息不充分,我们难以对这一环节进行充分、透彻的分析,上述推测也有可能并不是问题的真正原因,仅供参考。

四、不是结论的结论

通过琼脂糖凝胶电泳图,我们发现这批RNA样本全部存在两个异常:1) 有降解,2) 有杂带。尽管RIN值看起来不错,有些还大于8.0,但是实际上这些RNA样本的质量是存在一定问题的。


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