注册 登录  
 加关注
   显示下一条  |  关闭
温馨提示!由于新浪微博认证机制调整,您的新浪微博帐号绑定已过期,请重新绑定!立即重新绑定新浪微博》  |  关闭

云地日志

立身娉婷北高峰,花事纷纭心事秾。飓风和雨吹折后,病枝弱叶一扫空。

 
 
 

日志

 
 

二代测序的DNA浓度测定  

2015-08-21 22:17:12|  分类: 二代测序 |  标签: |举报 |字号 订阅

  下载LOFTER 我的照片书  |

二代测序的DNA浓度测定 - 陈云地 - 云地日志
 

二代测序离不开DNA浓度测定。需要测定浓度的地方有两个:文库构建之前;上cBot进行cluster generation之前。

目前常用的DNA浓度测定方法有以下几种:NanoDrop,Qubit,real-time PCR,Agilent 2100 Bioanalyzer。

那么,在什么时候选择什么方法最好呢?最好当然是指以最小的代价满足实验需求,而不是那种不计成本的土豪作派。

一、DNA质检,浓度不需要非常准确

文库构建之前,我们选择NanoDrop,而不是Qubit。(此处可能有板砖大规模来袭(^_^))理由是:
1、厂家官方推荐的文库构建DNA用量是一个范围,而不是一个数字。也就是说,文库构建试剂盒对于DNA用量有一定的容忍度。也就是说,DNA量不需要很准确。
2、NanoDrop操作简便,测定速度快,对DNA的消耗量也很少(样本宝贵,不能浪费)。
3、NanoDrop能够给出OD260/280,用于判断样本纯度,Qubit不幸没有这个功能。

NanoDrop有缺点!是的,有缺点,我承认。
1、测定不够精确(此处可能有板砖)。——为建库目的,并不需要非常精确,可以适当有点误差和波动。
2、样本里面的某些杂质也被当成DNA测定,对于测定值有贡献,导致浓度值虚高。——a。在文库构建的反应体系中,样本只占很小一部分,杂质被稀释。b。建库过程中有很多磁珠纯化步骤,越到后来越纯。
3、NanoDrop与Qubit的测定值不一致,而厂家官方推荐的是Qubit测定值。——这是可以解决的。我们统计了大量同一样本在两种设备上的测定值,并找到了二者之间的对应关系。比如,用Qubit测定是100 ng,用NanoDrop测定就变成了400 ng左右。

***有人说,你们建库DNA用量太高,都400 ng,比别人高了4倍。——天地良心,其实只有100 ng啦。NanoDrop测的。***

DNA质检,我们采用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop两项检验。

二、文库质检,浓度需要高度准确

文库上cBot进行cluster generation,对于input量准确性的要求就不同了,越精确越好。我们选择Qubit。

事实上,我们该严谨的时候,那是一点也不马虎。文库质检采用三项检验同时进行,Qubit测定浓度,琼脂糖凝胶电泳,以及Agilent 2100 Bioanalyzer,而且每项检验只取其中最好的一个参数,三方结合在一起,获得高度准确的摩尔浓度。

具体说来,就是Qubit只取其测定的重量浓度(ng/uL);2100只取其测定的文库片段长度。二者结合,计算文库的摩尔浓度;琼脂糖凝胶电泳用于观察文库的整体情况,片段长度是否符合预期,片段长度分布情况,是否有杂带,是否有引物二聚体或接头二聚体残留等等。如果有二聚体残留,则进行纯化。

为了一个目的(上机测序),进行了三项检验——还有比这更土豪的土豪吗?(此处求包养)

三、定量PCR要看样本类型是否适用,不宜盲目追求

如果有人对定量PCR有兴趣,毫无疑问,我们也提供定量PCR服务。
当然,不是花钱越多效果就越好。

定量PCR适用于FFPE样本制备的文库和PCR-free方法构建的文库,它测定的是“可PCR文库”的浓度。对于二代测序来说,也可以叫“有效文库”浓度。

FFPE样本DNA存在交联以及部分碱基损伤,阻碍PCR的进行;PCR-free文库里包含接头连接不完整的文库,阻碍PCR的进行。而cluster generation最核心的步骤之一,就是桥式PCR (Bridge PCR)。桥式PCR做不好,cluster就长不好,就测不到该片段的序列。




  评论这张
 
阅读(1875)| 评论(1)
推荐 转载

历史上的今天

在LOFTER的更多文章

评论

<#--最新日志,群博日志--> <#--推荐日志--> <#--引用记录--> <#--博主推荐--> <#--随机阅读--> <#--首页推荐--> <#--历史上的今天--> <#--被推荐日志--> <#--上一篇,下一篇--> <#-- 热度 --> <#-- 网易新闻广告 --> <#--右边模块结构--> <#--评论模块结构--> <#--引用模块结构--> <#--博主发起的投票-->
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

页脚

网易公司版权所有 ©1997-2017