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日志

 
 

RNA样本中残留的DNA污染要不要进行纯化?  

2015-08-26 00:20:48|  分类: 二代测序 |  标签: |举报 |字号 订阅

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RNA样本的DNA污染要不要纯化 - 陈云地 - 云地日志
 

 

对于二代测序来说,如果RNA样本中残留有DNA污染,要不要先用DNA酶把污染的DNA消化干净,然后再进行建库和测序呢?

可能我要准备好迎接一大波砖头来袭:这个问题太“图羊图那啥”了!因为答案显而易见:当然要纯化,不然会影响测序。只要我正儿八经地提出这个问题,我相信所有人都会斩钉截铁地回答说:要!

问题是,清谈是一回事,实干是另一回事。当样本真的遭遇DNA污染的时候,很多人又会心存侥幸:“也许不纯化,也不会有多少坏处吧?”如果情况再糟糕一点,碰巧样本量又不够多,刚刚好只够做一次二代测序,就会有更多人说:“做吧,你做吧,不要纯化了,做完了再说。”

有没有人真的这么干过呢?我相信你基本没有机会看到这样的数据。因为,只要是这么干过的人,百分百都不会公开他的实验结果。

好吧,那就让我来给大家见识一下这朵奇葩——收过不谢,叫我雷锋。

 

样本RNA是这样的,看琼脂糖凝胶电泳图,从左至右,编号依次为1号、2号、3号、……、12号,刚好12个一打。RNA质量相当不错,RIN值最低的都有8.4;比较遗憾的是,其中5个样本(2381011)多多少少存在DNA残留,3个残留比较少,2个残留严重。对于RNA而言,它们就是污染;对于我们即将进行的测试而言,这是很幸运的,因为DNA污染的严重程度各不相同,轻微的和严重的都有,还有没有污染的样本,正好用来作对照——多么理想的组合啊,不说千载难逢,也算百年一遇吧?

RNA样本的DNA污染要不要纯化 - 陈云地 - 云地日志

 

RNA样本的琼脂糖凝胶电泳图

 

RNA样本质检数据总结

RNA样本的DNA污染要不要纯化 - 陈云地 - 云地日志
 

建库采用Ribo-Zero方法——不要问我为什么不用TruSeq方法。碰巧这几个样本是Ribo-Zero测序,碰巧其中有部分样本存在DNA污染,碰巧我们可以验证DNA污染是否会对二代测序数据产生影响,如此而已——不然的话,你以为还会怎么样?我们又不是土豪,哪来这么多的闲钱来进行这样悠闲的研究。

 

这批RNA样本的测序数据整理如下表。相当不错吧?全部样本的%Q30>90%。有多少同学可以做到这样?请举手。

RNA样本的DNA污染要不要纯化 - 陈云地 - 云地日志

  

然而,测序数据好并不是说就没有问题了。

对测序数据进行深度分析发现,有DNA污染的那5个样本中,3个污染程度轻的样本,也就是2号、3号和10号样本,各方面的数据QC指标都与无DNA污染的样本基本一样,没有明显差异,2个污染严重的样本,也就是8号和11号,来自intronintergenic区域的read数异常偏多(看表)。 RNA样本的DNA污染要不要纯化 - 陈云地 - 云地日志

 

如果进一步细分的话,比较污染与无污染的样本,intron区域的read数差别较小,大致是29%22%的区别;而intergenic区域的read数差别很大,一个是大约11%,一个是大约6%,也就是说,有更多的read没有gene与之相对应。总之,与无污染的样本相比,来自mRNAread数显著降低。

无效数据量的多少与污染的严重程度成正相关。

 

其实这个结论不需要证明。我们的数据只不过是完美地验证了一个常识而已,实在不值得。

Ribo-Zero方法的策略是针对性消除总RNA中的rRNA,然后把剩下的部分全部当成mRNA去进行建库、测序。如果样本中存在DNA污染,这些污染的DNA就会保留在Ribo-Zero处理后的产物中,被当成RNA来进行测序,所以测序数据中有内含子序列和基因间序列。实际上,DNA污染的负面影响还不止于此:测序得到的外显子序列中,也有一部分是来自污染的DNA,而不全部来mRNA。毫无疑问,这样的结果会影响数据分析结论的准确性。

如果采用TruSeq方法,而不是Ribo-Zero方法,DNA污染会有影响吗?我们并不打算进行这样的测试。理论上,polyT磁珠能够富集mRNADNA污染似乎不会被测序,至少影响的严重程度比Ribo-Zero方法要轻。但是,一定会有部分DNA片段残留在polyT磁珠富集产物里,并被当成RNA测序的。

 

结论:只要有污染,无论是RNADNA污染,还是反过来,DNARNA污染,就一定要先消除它!

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