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云地日志

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影响二代测序数据的因素都有哪些?  

2015-08-26 17:00:02|  分类: 二代测序 |  标签: |举报 |字号 订阅

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影响二代测序数据的因素都有哪些? - 陈云地 - 云地日志

 

一、取法乎上,仅得乎中

 

二代测序的特点就是大规模测序,大规模测序就要大规模花钱。尽管平摊到每个碱基上,二代测序的成本是很低的,而且下降速度喜人,都少有地超过了计算机科学的摩尔定律,但是因为碱基数目庞大,动辄以G、以M计,所以每次测序的总价都不是小数目。这就要求我们在做项目时小心又小心,力争所有样本都一次测序成功,不浪费宝贵的科研经费。所谓如临深渊,如履薄冰,真是我们这些测序狗的个性化定制的精准写照。

 

哪些因素会影响二代测序数据质量呢?我们按从大到小的顺利整理一下思路,只要绕过这些暗礁,把测序做好、把每一次测序都做好,也并不难。

 

实验室管理要做好,质量管理标准要高,选最严格的。

技术平台要选好,选最好的。

试剂质量要靠谱,选最大牌的。

样本质量要保证,不遗余力做到最完整(无降解、无凋亡)、最纯净(无污染、无残留),不盲目追求碱基修补。

样本的摩尔量要保证,不盲目追求low input、单细胞、单分子。

 

二、CRO服务

 

对于开展CRO服务的公司来说,还有一种特殊性:当他们通过质检发现客户样本/客户文库存在质量/数量问题的时候,以及当他们无法确认客户样本/客户文库是否能够满足二代测序的最低要求的时候,他们有责任提醒客户测序存在风险。

 

        以一家虚拟的二代测序代客服务公司为例,我们可以通过观察他是否诚实地做到以下这些,来判断他是否忽悠。可能很多老师不喜欢我罗列的这些条目,但是在做项目时一定要多个心眼。只要是大包大揽,一定离忽悠不远。

        客户提供样本,CRO公司负责建库和测序,如果样本质量经过质检评定为B级或者C级,CRO公司要提醒客户存在测序风险。

 

客户自制文库,CRO公司负责上机测序,CRO公司不应承诺任何数据质量指标,包括数据产量和%Q30比例。

客户自制文库,混合样本测序,barcode组合要保持碱基组成平衡。如果Barcode组合的碱基组成不平衡,会导致数据量减少,以及难以完成demultiplexing。

客户自制文库,混合样本测序,样本本身要保持碱基组成平衡。样本碱基组成不平衡会导致数据量和数据质量下降。

 

CRO公司负责建库,包lane测序,CRO公司应承诺整条lane的总体数据量,但是不应承诺混合在一起的每个样本的单独数据量。

CRO公司负责建库,包每个样本数据量,CRO公司应承诺每个样本的单独数据量。

 

 

三、常见质量问题举例

 

 

常见的质量问题比如:

DNA降解、RNA降解样本,比如保管不当;

细胞凋亡样本,特别是肿瘤组织样本;

DNA损伤样本,比如FFPE样本;

样本被污染,比如DNA残留、RNA残留、糖含量高等;

样本含量低,比如组织活检样本、激光捕获样本;

要进行小RNA测序,但是总RNA样本中小RNA含量少,比如RNA提取流程不恰当;

ChIP样本总量少,通常是因为抗体质量欠佳。

 

样本标记错误,完全是因为粗心,更是因为没有检查防范纠正机制,实验室管理松散;

样本运输条件不当,随心所欲,不遵守客观规律,想人定胜天。

 

文库里面有adaptor二聚体残留;

文库与接头的连接不完整,比如插入片段一头有接头,一头没有;

文库片段长度不理想,比如插入片段的长度超过800碱基;

长文库与短文库混合在一起,决定上机浓度的时候,是照顾长的好,还是照顾短的好呢?愁死了。

文库存在TT交联,比如FFPE样本。

最后,也是最重要的一点——文库的碱基组成不平衡!

 

四、碱基不平衡

 

常见的碱基组成不平衡的样本类型比如:甲基化、扩增子、转录组、ChIP、重复序列测序(16S rDNA, HLA…)等等,其中重亚硫酸盐处理后的甲基化样本是碱基组成极度不平衡的,基本没有C,只有A、T、G三种碱基,而T的含量又比正常样本增加几乎一倍。

碱基不平衡的样本可以与碱基平衡的样本混合以改善平衡程度,常见碱基平衡的样本比如人全基因组、人外显子组、Illumina标准品文库PhiX等,

平衡与不平衡样本的混合比例,根据样本的不平衡的严重程度调整。

其中PhiX可以同时起到两个作用:改善碱基平衡度,作为阳性对照监控测序操作是否成功。

 

 

二代测序涉及的实验难点和异常比较多,难以一一罗列,最好的处理方式是多交流,针对每一个项目的具体情况和实验进展,保持通畅、及时、充分的沟通。

 

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